Neurofiziológiai módszerek a gerincvelő-kutatásban

Whole-cell patch-clamp kísérletek

 


 

A patch-clamp módszert elsőként Bert Sakmann és Erwin Neher írta le az 1970-es években. Felfedezésüket 1991-ben Nobel-díjjal jutalmazták. A technika elve egyébként meglehetősen egyszerű: üvegből húzott mikroelektród képez szoros kapcsolatot a vizsgálni kívánt sejt membránjával, mely egy erősebb szívást követően felszakad, és az elektródot megtöltő intracelluláris oldat kapcsolatba kerül a sejt cytoplasmájával. Ekkor a membránpotenciál, ill. a membránon átfolyó áram nagyérzékenységű műszerekkel mérhető, időbeli változásuk regisztrálható. A módszer alkalmazható izolált, tenyésztett sejteken vagy élő szeletpreparátumokban lévő neuronokon egyaránt.

 

A rövid animáció megtekintéséhez kattintson a fenti képre!

Lap tetejére

 

A kísérleteket 3-4 hetes Wistar patkányok lumbalis gerincvelőszakaszán végezzük. Az ilyen fiatal állatokból származó szeletek jobban viselik a preparálás folyamatát és az ennek során fellépő hypoxiát, míg idősebb állatokban a kifejezettebb myelinizáció miatt a kísérletek kivitelezhetősége drasztikusan romlik. Az urethánnal elaltatott állatokon laminectomiát végzünk, a gerincvelő lumbalis szakaszát egyben kiemeljük, s jéghideg, oxigenizált aCSF-be (mesterséges cerebrospinalis folyadék) tesszük. Az alacsony hőmérsékleten csökken a sejtek anyagcseréje és oxigénigénye, így a szöveti károsodás minimalizálható. Eltávolítjuk a gerincvelőt körülvevő burkokat, majd hagyományos vibratómmal a kísérlet céljától függően 300-800 µm vastagságú szeleteket készítünk, s az egyikoldalon lehetőség szerint megtartjuk a belépő hátsó gyökereket is. A szeleteket a mérések megkezdése előtt közel testhőmérsékletre melegítjük vissza: legalább fél-1 órán át 33-35°C-os, oxigenizált aCSF-ben inkubáljuk őket.

  

A laminectomia után láthatóvá váló gerincvelő és a szeletkészítéshez hasznát vibratóm.

Lap tetejére

 

A gerincvelőszeleteket a rekordáló kamrába helyezzük, melyen folyamatosan oxigenizált aCSF-et áramoltatunk át.

A "vak" kísérletekben kis nagyítás mellett határozzuk meg a célterületet. Például a substantia gelatinosa mint a hátsó szarv áttetsző rétege jól azonosítható. Az elektróddal a szeletben haladva folyamatos feszültségimpulzusok alkalmazása mellett mérjük a patch-elekródon átfolyó áram nagyságát. Az áram drasztikusan lecsökken, mikor a mikroelektród eléri egy sejt felszínét. Ezzel a módszerrel véletlenszerűen választjuk ki a vizsgálni kívánt régió neuronjait, a kísérletezőt nem befolyásolja a sejt megjelenése, alakja, mérete.

A "vizuális megközelítés" módszerénél nagyobb nagyítást alkalmazunk, és a DIC (differenial interference contrast) technika segítségével, infravöröshöz közeli megvilágítás mellett tesszük láthatóvá a neuronokat, melyekre az elektródot mintegy rávezetjük. Megjelenésük alapján az élő sejtek jól elkülöníthetők a haldokló vagy elpusztult sejtektől, így nem kell időt pazarolni a vizsgálatra eleve alkalmatlan neuronokra.

   

A mikroszkóp, a rekordáló kamra és a vízimmerziós objektív, valamint a gerincvelőszelet képe.

 Jobb szélen a DIC technikával láthatóvá tett neuron és az őt megközelítő elektród.

Lap tetejére

 

A membrán felszakítása után kétféle mérési módra van lehetőség. A voltage-clamp kísérletekben a membránra egy a célnak megfelelő nagyságú potenciált kényszerítünk, és annak az áramnak a nagyságát és irányát mérjük, mely az adott membránpotenciál fenntartásához szükséges. Current-clamp módban a membránpotenciált mérjük, s azt vizsgáljuk, hogy különböző irányú és nagyságú, a sejtbe injektált áramok hogyan változtatják meg az adott neuron membránpotenciálját.

     

Változó nagyságú és irányú áramlépcsők (lent) hatása a sejt membránpotenciáljára (fent).

Kellő mértékű depolarizációt előidéző áram hatására akciós potenciálok jelennek meg.

Lap tetejére

 

A hátsó gyökér elektromos ingerlésével excitatorikus posztszinaptikus potenciálokat (EPSP - current-clamp mérésnél), ill. áramokat (EPSC - voltage-clamp kísérletekben) válthatunk ki a hátsó szarv neuronjainak jelentős hányadában. Az. Aδ- és C-rostokon érkező EPSP-k/EPSC-k a rostok eltérő vezetőképessége (C-rost: 2-13 m/s és Aδ-rost <0.8m/s) és ingerküszöbe (C-rost: 150-550µA, Aδ-rost: 10-60µA) alapján különíthetők el egymástól. Monoszinaptikus bemenetről beszélünk, ha a primer afferensek közvetlenül végződnek a vizsgált sejten. Erre utal, ha a hátsó gyökeret érő minden egyes inger után azonos latenciával jelenik meg a válasz,  és ha Aδ-rostoknál 20Hz-es, C-rostoknál 2Hz-es sorozatingerlésnél még minden egyes ingert válasz - EPSP/ EPSC - követ (hiányzik a failure-nek nevezett jelenség).

Egyetlen ingerrel (fent) és sorozatimpulzusokkal (lent) kiváltott EPSP-k.

Lap tetejére


 

A patch-clamp felszerelésünk komponensei:

Mikroszkóp

Olympus BX51WI   >>>

(vízimmerziós objektívvel, DIC prizmákkal, epifluoreszcens megvilágítással, filterekkel)

Patch-clamp erősítők

Axoclamp-2A

Axopatch-200B   >>>

 

Digitális kamera

F-View II digital camera   >>>

Adatrögzítő berendezések

Axon Digidata 1320

Axon MiniDigi

Mikromanipulátor

Sutter MP-225   >>>

Stimulátor és stimulus izolátor

A.M.P.I. Master-8   >>>

A.M.P.I. Iso-Flex   >>>

Elektród húzó

Sutter P-97   >>>

 

Egyéb

Hitachi oszcilloszkóp

PC, célszoftverek

     

Lap tetejére