Morfológiai módszerek a gerincvelő-kutatásban

Immunhisztokémia


 

A membránreceptorok, az intracelluláris fehérjék és számos további makromolekula antigénként viselkedik. Jelenlétük vagy hiányuk, szöveti megoszlásuk antigén-antitest reakciókkal vizsgálható. Az antigénkimutatásra használt antitesteket csapadékot képző enzimekkel, fluoreszcens festékekkel vagy radioaktív izotópokkal lehet jelölni. A módszert Albert H. Coons és kollégái 1941-ben írták le.

Alapvetően megkülönböztetünk direkt is indirekt technikát. A direkt módszer használatakor a kimutatni kívánt antigénhez kötődő antitestet jelöljük. Sokkal elterjedtebb és gazdaságosabb a technika indirekt változata, amikor jelöletlen primer antitest kötődik az antigénhez, majd ehhez kapcsolódik a jelölt szekunder ellenanyag. Mivel a primer ellenanyaghoz több jelölt szekunder antitest is kötődhet, a jel erősebb lesz, így kisebb mennyiségben jelen lévő antigén is detektálható

 

Direkt és indirekt immunhisztokémia

Lap tetejére

 

A klasszikus immunhisztokémiai módszereket illetően vagy biotinilált szekunder antitesteket használunk, melyekhez specifikusan kötődik az Extravidin-HRP konjugátum, vagy eleve HRP-vel jelölt másodlagos ellenanyagokat alkalmazunk. Mindkét esetben kulcsfontosságú a tormaperoxidáz (HRP) enzim, mely  diamino-benzidinből (DAB) H2O2 jelenlétében ott hoz létre barnás csapadékot, ahol a szövetben a kimutatni kívánt antigén van. A DAB-reakciót követően a metszetek fénymikroszkóppal vizsgálhatók.

 

Biotinilált szekunder antitest, és a hozzá kötődő Extravidin-HRP, ill. HRP-vel jelölt másodlagos ellenanyag:

a DAB-csapadék keletkezése.

 

Sötétbarna csapadék jelzi a CART-immunreaktív struktúrák elhelyezkedését a gerincvelő felületes lamináiban.

Lap tetejére

 

A többes fluoreszcens jelölés különböző antigének egyidejű kimutatását is lehetővé teszi. Ehhez az egyszerre használt primer antitestek mindegyike más állatfajból kell származzon, az állatspecifikus szekundereket pedig különböző színű fluoreszcens festékekkel kell jelölni. Konfokális mikroszkóppal az is megállapítható, hogy az egyes antigének előfordulnak-e együttesen, azaz van-e kolokalizáció.

 

Három különböző antigén, melyeket különböző fluoreszcens antitestekkel teszünk láthatóvá.

 

  

Hármas fluoreszcens jelölés patkány gerincvelő lamina I-ében (zöld: synaptophysin, piros: CART, kék: substance P).

Jobbra: a kevert színek eredete.

Lap tetejére

 

A fluoreszcens immunhisztokémia és az elektronmikroszkópia együttes alkalmazása egy további lehetőség. A fluoreszcens immunhisztokémiai eljárás és konfokális mikroszkópos analízis után a metszeteken klasszikus DAB-reakciót végzünk, s a csapadékkal jelölt struktúrákat elektronmikroszkóppal vizsgáljuk. Míg a fluoreszcens festéssel egyidejűleg több antigén is láthatóvá tehető, a DAB-reakcióval már csak az egyik, valamilyen szempontból fontos antigén elhelyezkedése tanulmányozható.

 

 

Az egyik primer antitesthez fluoreszcensen és HRP-vel jelölt szekundereket is kötünk.

A HRP enzim által képzett DAB-csapadék elektronmikroszkóppal vizsgálható.

 

Ugyanazon metszet konfokális miroszkópos, ill. elektronmikroszkópos felvételen.

A sejtmembránt kirajzoló antitestek zöldben, a pályajelölővel töltött terminális pirosban. Az EM kép megerősíti,

hogy a piros fluoreszcens festéssel és DAB csapadékkal jelölt terminális szinapszist képez a sejttel.

Lap tetejére

 

Laborunkban a retrográd pályajelölő anyagok közül leginkább a Cholera-toxin béta-alegységet használjuk, rendszerint a gerincvelő I. és III-IV. laminájában lévő projekciós neuronok azonosítása a cél. Ezek a sejtek az agytörzs különböző területeire küldik axonjaikat: a végződések elérik a caudalis ventrolateralis nyúltvelőt, a lateralis parabrachialis magot és a periaqueductalis szürkeállományt. A gerincvelő projekciós neuronjainak többsége jelölődik, ha sztereotaxiás műtét során a fenti területek valamelyikére juttatjuk be a tracert. A beadási helyet többnyire hagyományos DAB-reakcióval ellenőrizzük, sikeres célzás esetén a gerincvelőn többes fluoreszcens immunfestést végzünk.

 

Beadási hely az agytörzsben, retrográd úton jelölt projekciós sejtek a gerincvelő horizontális metszetében.

Többes fluoreszcens jelölés (Cholera-toxin: kék, NK1-receptor: zöld, CART-peptid: piros).

Lap tetejére